ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ISOFLAVON DARI KACANG KEDELAI (Glycine max)

Nama : Valdis Reinaldo Agnar
NPM : 260110080081
Sumber : http://ejournal.unud.ac.id/abstrak/j-kim-vol3-no1-astiti%20asih.pdf

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ISOFLAVON DARI KACANG KEDELAI (Glycine max)

Penyiapan bahan
Biji kedelai dibersihkan kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dihaluskan sampai berupa serbuk.

Ekstraksi dan fraksionasi senyawa flavonoid
Sekitar 1740 g serbuk biji kedelai dimaserasi dengan metanol teknis sebanyak 10 L. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dan diuapkan dengan menggunakan penguap putar vakum (rotary vacuum evaporator) sampai diperoleh ekstrak kental metanol sebanyak 71,82g. Ekstrak ini kemudian dihidrolisis dengan HCl 2N selama 2-3 jam. Hasil hidrolisis diekstraksi dengan n-heksana. Ekstrak n-heksana yang diperoleh diuapkan dengan penguap putar vakum sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksana sebanyak 2,61 g, kemudian ekstrak kental yang diperoleh diuji dengan uji flavonoid.

Metode Pemisahan dan Pemurnian
Pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan cara kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.
a) Kromatografi lapis tipis ( KLT )
Pemisahan dengan KLT digunakan untuk mencari fase gerak yang terbaik yang akan digunakan dalam kromatografi kolom. Fase diam yang digunakan pada KLT adalah silika gel GF254 dan sebagai fase gerak digunakan n-heksana, kloroform, etil asetat dan n-butanol. Bejana kromatografi sebelum digunakan untuk elusi, terlebih dahulu dijenuhkan dengan fase geraknya. Sedikit fraksi positif flavonoid yaitu fraksi n-heksana dilarutkan dengan pelarutnya (eluen yang akan dipakai) kemudian ditotolkan pada plat kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pipa kapiler. Setelah kering lalu dimasukkan dalam bejana. Bila fase gerak telah mencapai batas yang ditentukan, plat diangkat, dan dikeringkan di udara terbuka. Sebagai penampak noda digunakan asam sulfat. Noda yang terbentuk diamati dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm kemudian dihitung Rf-nya.

b) Kromatografi kolom
Fase diam yang digunakan pada kromatografi kolom adalah silika gel, sedangkan fase geraknya digunakan fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik pada KLT. Silika gel 60 (70-100) Mesh terlebih dahulu dipanaskan dalam oven pada suhu 1100C, kemudian ditambahkan sedikit fase geraknya sehingga menjadi bubur. Pelarut (fase gerak yang digunakan) dimasukkan ke dalam kolom sampai hampir penuh dan keadaan kran kolom tertutup. Setelah itu kecepatan aliran kolom diatur dan bubur dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom sampai seluruh bubur masuk ke dalam kolom. Setelah bubur masuk, fase diam ini dielusi hingga homogen (kolom ini didiamkan selama 1 hari sehingga diperoleh pemampatan yang sempurna). Sementara itu sampel dilarutkan dalam pelarut, kemudian sampel dimasukkan dengan hati-hati melalui dinding kolom dan aliran fase gerak diatur. Begitu sampel masuk ke dalam fase diam, fase gerak ditambahkan secara kontinyu sampai terjadi pemisahan. Eluat ditampung pada botol penampung fraksi setiap 3 mL, kemudian keseluruhan fraksi yang dihasilkan dilakukan KLT penggabungan.
Fraksi hasil KLT penggabungan yang mempunyai pola pemisahan sama (harga Rf sama) digabungkan, kemudian diuapkan dengan penguap putar vakum dan masing-masing kelompok fraksi yang diperoleh diuji dengan pereaksi flavonoid.

Uji Fitokimia
Pemeriksaan golongan flavonoid dapat dilakukan dengan uji warna yaitu :
1. Test Wilstatter
Beberapa mililiter sampel dalam alcohol ditambahkan 2-4 tetes larutan HCl dan 2-3 potong kecil logam Mg. Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi orange.
2. Test dengan NaOH 10%
Beberapa mililiter sampel dalam alcohol ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%. Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi kuning muda.
3. Test dengan H2SO4 (pekat)
Beberapa mililiter sampel dalam alcohol ditambahkan 2-4 tetes larutan H2SO4 (pekat). Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi merah tua.

Uji Kemurnian
Uji kemurnian dilakukan menggunakan berbagai campuran fase gerak, yaitu n-heksana, kloroform, etil asetat dan n-butanol. Jika isolate tetap menunjukkan noda tunggal pada plat kromatogram dengan fase gerak yang berbeda, menunjukkan isolat relatif murni secara KLT, bahwa isolat tersebut hanya mengandung satu macam senyawa.

Karakterisasi Golongan Senyawa Flavonoid
Karakterisasi golongan senyawa flavonoid dilakukan dengan metode spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometri inframerah.
a. Karakterisasi golongan senyawa flavonoid dengan spektrafotometer UV-Vis
Pengukuran spektrum UV-Vis dilakukan pada panjang gelombang 250-500 nm. Sebanyak 1 mg isolat dilarutkan dalam 100 mL methanol (larutan persediaan), kemudian diukur panjang gelombangnya. Selanjutnya untuk mengetahui kedudukan gugus hidroksi pada inti flavanoid dilakukan dengan menambahkan pereaksi geser ke dalam larutan cuplikan. Pereaksi geser yang digunakan antara lain natrium hidroksida, natrium asetat, natrium asetat dan asam borat, aluminium klorida, aluminium klorida dan asam klorida. Tahapan keja penggunaan pereaksi geser adalah sebagai berikut :
a. Setelah mengukur spektrum cuplikan dalam metanol, ditambahkan 3 tetes NaOH ke dalam kuvet, dikocok hingga bercampur. Kemudian diukur panjang gelombangnya. Setelah diukur, cuplikan dibuang dan sel dicuci.
b. Pengukuran spektrum dengan pereaksi geser NaOAc dilakukan dengan cara menambahkan serbuk NaOAc dalam kuvet yang berisi larutan persediaan hingga terdapat kira-kira 2 nm lapisan NaOAc pada dasar kuvet, lalu dikocok, kemudian diukur. Pengukuran spektrum NaOAc + H3BO3 diukur setelah ditambahkan serbuk H3BO3 pada larutan persediaan yang kemudian dicampur/dikocok (banyaknya serbuk H3BO3 kira-kira setengah dari NaOAc yang ditambahkan sebelumnya). Setelah diukur, cuplikan dibuang dan sel dicuci.
c. Pengukuran spektrum dengan pereaksi geser AlCl3 dilakukan dengan menambahkan enam tetes pereaksi geser AlCl3 ke dalam larutan persediaan, kemudian diukur panjang gelombangnya. Untuk spektrum dengan pereaksi geser AlCl3 + HCl dilakukan dengan cara menambahkan tiga tetes HCl, kemudian dicampur dan diukur. Akhirnya cuplikan dibuang dan sel dicuci.
b. Karakterisasi gugus fungsi golongan senyawa flavonoid dengan spektrofotometer inframerah (IR)
Isolat aktif yang diduga golongan senyawa flavonoid yang telah murni dicampur dengan nujol. Campuran yang terbentuk selanjutnya ditempatkan pada dua buah lempeng kristal NaCl dan dimasukkan ke dalam alat inframerah, kemudian diukur serapannya.